15 мая 1565 г. Рыцари Иерусалимского Ордена св. Иоанна собрались на внеочередное Общее Собрание, чтобы в последний раз обсудить свои действия перед грядущей битвой и осадой. Они смотрели друг на друга, сомневаясь, что снова увидятся на следующей ассамблее. Гроссмейстер Ла Валетт долго разъяснял Рыцарям их обязанности в предстоящем сражении, однако история сохранила лишь его последние слова: «…Это будет великая битва Креста и Корана. Бесчисленная армия неверных надвигается на наш остров. Мы избранные солдаты Креста, и если святые небеса потребуют пожертвовать собой, то нет лучшего случая, чем этот. Поспешим же тогда, братья мои, на этот священный алтарь. Вспомним наши клятвы, выкажем презрение к смерти ради нашей веры, и это сделает нас непобедимыми». С эти последними словами своего вождя, все Рыцари вскочили с мест в едином порыве, забыв обо всех разногласиях, которые были между ними. Затем все они торжественным маршем проследовали в главный храм Ордена, где причастились.

После этого они уточнили свои оборонительные действия.Ла Валетт полагал, что турки будут атаковать с юго-востока со стороны Марсашлокка, где и будет стоять их флот. Но он не исключал возможности атаки с северного берега у Марсамшетта, прилегающего к Большой Гавани. Для этого было очень важным, чтобы гарнизон форта Сент-Эльмо, защищающий обе части гавани был хорошо укомплектован.

Обычно он состоял из 6 Рыцарей и 600 воинов под командой пьемонтского Рыцаря Луиджи Бролья. Теперь Ла Валетт послал к нему в качестве заместителя молодого Рыцаря Хуана де Гуареса и еще 46 других Рыцарей, вызвавшихся добровольцами из разных национальных подразделений Ордена («Языков»). 13 мая прибыли 200 испанских солдат из тысячи, обещанной вице-королем Сицилии. Они также усилили гарнизон форта.Большинство Орденской кавалерии было отправлено в Мдину, для усиления тамошнего гарнизона. Другой отряд был послан в цитадель на острове Гоцо. Остальные отряды Рыцарей и мальтийских пехотинцев разместились в Биргу, форте Сан-Анджело и форте Сент-Микаэль с возможностью поддерживать друг друга соответственно силе вражеского нажима. С такой диспозицией Ла Валетт приготовился ко дню битвы, и тот не заставил себя ждать.18 мая 1565 г. турецкая армада показалась на горизонте. Форты Сан-Анджело и Сент-Эльмо произвели по три пушечных выстрела, что было условным знаком, быстро повторенным из Мдины и цитадели Гоцо, поднявшим по тревоге Рыцарей, войско и всех жителей, как и планировал Ла Валетт.

Следующие несколько часов повсюду творилось полное сумасшествие. В Биргу и Сенглеа моряки старались организовать дозоры, в то время как войско и Рыцари на бастионах в последний раз осматривали своё оружие и снаряжение. Организованные и спокойные действия воинов вскоре нарушили многочисленные крестьяне, прибывшие в город со своими лошадями, ослами, запасами продовольствия и с домочадцами, нагруженными домашним скарбом. И в стенах Биргу, Сенглеа и Мдины помимо обычного шума солдат и оружия стали раздаваться крики животных и их владельцев. Это особенно раздражало знать в Мдине. Их дома находились внутри стен, и они никуда не собирались оттуда уходить, желая игнорировать предстоящий конфликт. Проблемы большинства населения вокруг Биргу и гавани их не волновали.

Хорошо, что турки не стали высаживаться в первый же день и дали населению шанс убежать. Ла Валетт послал отряд кавалерии вдоль берега вслед за турецким флотом, для разведки. Он также послал людей отравить колодцы в Марсе. Через залив между фортом Сан-Анджело и Сенглеа протянули толстую цепь, чтобы перекрыть путь для атаки с моря, но оставили для себя возможность послать небольшое судно на Сицилию, сообщить вице-королю, что нападение началось, и Ла Валетт нуждается в помощи больше, чем раньше.Турки начали высадку в Марсашлокке в полдень субботы 19 мая. Они высадили около 3000 чел. с целью захватить скотину и продовольствие. Те, ничего не найдя, прошли полторы мили до деревни Зейтун, где и повстречали первый отряд Рыцарей. Последовало столкновение, и отряд отступил, потеряв первых убитых. Два Рыцаря француз Адриен де ла Ривьер и португалец Бартоломеу Фарауне были пленены и препровождены к Мустафе Паше.

Под пыткой их спросили, где в обороне имеется слабое место. Когда мучение стало нестерпимым, они сказали, что это Кастильский бастион. На самом деле, Рыцари пытались обмануть Мустафу, поскольку Кастильский бастион был самым укрепленным местом.Ла Валетт отметил, что турки были удивлены, когда не обнаружили ничего, кроме пустой земли. Он пришел к выводу, что они будут атаковать Биргу и Сенглеа и решил перевести всех пехотинцев из Мдины в Биргу. Он оказался прав в том, что Мустафа Паша, которого разозлили многочисленные стычки, броситься в атаку на Кастильский бастион Биргу.

Мустафа Паша, приведя часть флота к Марсамшетту, начал свою атаку 21 мая.Ла Валетт и старшие Рыцари ожидали атаку, они приказали защитникам оставаться за стенами и открывать огонь, когда турки подойдут на расстояние выстрела. Но полчища турок, подходивших к укреплениям, произвели на молодых Рыцарей огромное впечатление. Старые и опытные Рыцари уже видели такое, но для молодых это было впервые, и многие из них бросились навстречу наступающим ордам неверных. Ла Валетт был недоволен, но решил использовать решимость молодых Рыцарей.

Схватка предстояла кровавая, но Ла Валетт не оставил их и выслал на помощь три отряда из Сенглеа и Биргу. Бой длился шесть часов. Артиллерия с бастионов наносила туркам большой урон, но дело решали удары клинков и мушкетные залпы. Когда численный перевес турок начал сказываться, Ла Валетт приказал своим людям отступать. Они потеряли 21 чел. убитыми и 150 ранеными, но смогли видеть сотни убитых турок на поле боя. Успех первого боя сильно поднял боевой дух Рыцарей и мальтийцев, сражавшихся вместе с ними, но и сильно разозлил турок.

Отдав приказ отходить, Мустафа Паша решил незамедлительно казнить обманувших его пленных Рыцарей, а затем атаковать Мдину и осадить Биргу и Сенглеа.